以嗜盐菌为底盘的下一代工业生物技术（NGIB）
生物制造作为利用生物体机能进行绿色生产的代表，虽具引领“第四次工业革命”潜力，却因传统模式依赖大肠杆菌等模式微生物，面临设备昂贵、工艺复杂、易染杂菌及灭菌能耗高等问题，成本高昂难以与化工竞争。“下一代工业生物技术”应运而生，其核心是以极端微生物（尤以嗜盐菌为典型）为底盘，通过开放式非灭菌连续发酵，实现设备简化、节能节水。基于嗜盐菌的新型生物制造已实现无需灭菌的连续生产，成功合成聚羟基脂肪酸酯（PHA）、四氢嘧啶、5-氨基戊酸及蛋白等多类产品，成为低成本生物制造的“生物制造2.0”典范。近年来，分子生物学技术推动下，嗜盐菌基因编辑工具开发及底盘细胞优化取得突破，加速了该领域发展。当前，嗜盐菌合成生物学正从工具创新向多产品协同拓展，为生物制造工业化提供可行路径。未来需聚焦代谢网络解析、规模化放大等关键方向，进一步推动其从实验室向产业端跨越。
图1以嗜盐菌H. bluephagenesis为基础的一个底盘细胞多种产品生产过程
一、嗜盐菌的生物学特性及优势
嗜盐菌是一类生长于NaCl浓度超1%环境的微生物，广泛分布于细菌、古菌、真菌中，如细菌中的蓝细菌、变形菌，古菌中的极端耐盐菌Halobacterium等。1978年Donn Kushner按最佳生长盐浓度将其分为四类：极端嗜盐菌（2.5~5.2mol/L）、边缘极端嗜盐菌（1.5~4.0mol/L）、中度嗜盐菌（0.5~2.5mol/L）及耐盐菌。目前生物制造中最常用的是盐单胞菌属（Halomonas），属中度嗜盐革兰氏阴性菌，其耐盐耐碱特性是核心优势：在高盐高碱环境中能快速生长，而杂菌受抑制，可省去发酵灭菌步骤，简化操作、降低设备成本；碱性培养环境还减少钢铁设备腐蚀，进一步降维修成本，为开放式连续发酵提供可能。不过，嗜盐菌遗传背景不清、基因编辑工具匮乏，曾制约其合成生物学发展，但随技术进步，其低成本、抗逆性优势正推动其成为生物制造2.0的重要底盘。
二、嗜盐菌的分子生物学工具开发
嗜盐菌分子生物学工具的开发是其合成生物学应用的核心突破。针对野生型菌株代谢产物单一、产量低的局限，近20年来研究者攻克了遗传背景不清、工具匮乏的挑战，开发出系列专用工具：
1、CRISPR/Cas9基因编辑系统：Qin等首次在盐单胞菌中建立双质粒表达系统（gRNA靶向+酿脓链球菌Cas9蛋白），实现高效基因敲除、插入或替换。该系统可精准编辑长达4.5 kb的基因片段，例如敲除prpC基因使聚羟基脂肪酸酯（PHBV）中聚羟基戊酸酯（PHV）比例提升16倍，为代谢工程改造奠定基础。
2、类T7诱导表达系统：Zhao等仿照IPTG-T7启动子调控机制，开发出IPTG浓度依赖性表达系统（0.2–20 mg/L）。该系统实现基因表达强度与IPTG浓度的线性关联，成功应用于形态工程改造——将盐单胞菌长度扩大100倍，显著提升聚羟基丁酸酯（PHB）产量。
3、PPorin Lab组成型启动子文库：通过随机突变高表达孔蛋白Porin的启动子核心区，构建包含95个启动子的文库，表达强度跨度达3500倍。该文库可精准调控外源基因表达，例如优化4-羟基丁酸合成途径后，使共聚物P34HB中4HB单体含量大幅提高。
图2多种嗜盐菌专用分子改造工具.
这些工具涵盖动态调控（类T7系统）、静态调控（启动子文库）及基因编辑（CRISPR/Cas9），共同支撑了嗜盐菌底盘细胞的系统性改造，推动生物制造向低成本、高效率升级。
三、嗜盐菌为底盘的生物制造产品
嗜盐菌凭借耐高盐碱性、开放式发酵及抗逆性优势，已成为多品类生物制造的高效底盘，覆盖生物材料、小分子化合物及蛋白质三大领域。在生物材料方面，其天然合成聚羟基脂肪酸酯（PHA）的能力备受关注：PHA是由100~30000个羟基脂肪酸聚合的生物聚酯，含150余种单体，可形成超10¹⁰种结构（如均聚物、共聚物），兼具优异性能与可降解性，是石油基塑料的理想替代品。嗜盐菌天然以聚3-羟基丁酸（P3HB）为主，经工程改造可扩展至含3-羟基戊酸（3HV）、4-羟基丁酸（4HB）等单体的共聚物。例如，Halomonas sp. YLGW01以果糖合成PHB，胞内积累量达细胞干重94.6%；H. bluephagenesis经改造后，以葡萄糖合成P34HB（3HB-co-4HB），7L罐发酵胞重26.3g/L，P34HB含量60.5%，4HB比例可控（13~25%），还能合成含3HHx的PHBHHx（3HHx比例13~37%）及功能性不饱和PHA（如PHBHHxE）。
小分子化合物生产中，嗜盐菌可合成酸性小分子、胞外多糖及相容性溶质。其中四氢嘧啶（ectABC基因调控）产量突出，Ma等调控H. bluephagenesis中ectABC表达，7L罐产量28g/L（联产PHB），Hu进一步优化至85g/L。氨基酸类小分子亦表现亮眼：Li构建5-氨基乙酰丙酸（ALA）通路实现与PHB共生产；Du合成L-苏氨酸（7L罐33g/L）；Zhao合成戊二胺（118g/L）；Yang以赖氨酸为底物获5-氨基戊酸67.4g/L。
蛋白质领域，嗜盐菌可分泌或胞内表达功能蛋白。Lan构建PhaP表面活性蛋白高效表达系统，开放发酵产量1.86g/L；Lin实现淀粉酶外泌，验证其作为分泌底盘的潜力；PhaR还可作生物表面活性剂。其酶类耐高盐、高温（如Haloarcula marismortui乙醇脱氢酶60°C/pH10仍高活性），胞内相容性溶质与PhaP分子伴侣作用进一步保护蛋白。这些成果彰显嗜盐菌在多产品合成中的高效性与多样性，为生物制造产业化提供核心支撑。
表1嗜盐菌为底盘的生物制造产品
四、嗜盐菌的形态学工程改造
形态学工程是通过改造细胞形态以增加产量、降低下游纯化成本的策略。PHA在细胞中以包涵体形式存在，当含量较高时，细胞体积成为影响产量的关键因素——既决定PHA含量上限，又能减小收集难度、增大颗粒尺寸、降低分离成本。增大体积可从宽度和长度两方面入手：MreB细胞骨架蛋白（调控宽度）和FtsZ微管样蛋白（调控长度）的缺失或过表达会改变细胞尺寸。Jiang等和Shen等通过过表达mreB和ftsZ，显著增大细胞体积，不仅提高单细胞内PHA含量与颗粒大小，还促进菌体自沉降。Tan等则在H. bluephagenesis中过表达minCD基因，使细胞长度增长数倍至百倍（菌丝超100μm），PHA含量从69%提升至82%；长菌丝相互缠绕实现静置自沉降，进一步简化分离流程。这些改造通过调控细胞形态，为高效生产PHA提供了新路径。
图3嗜盐菌的形态学工程改造
五、工程化嗜盐菌为基础的新型生物制造
工程化嗜盐菌为基础的新型生物制造（下一代工业生物技术/生物制造2.0）突破了传统生物制造设备昂贵、灭菌能耗高、转化率低等瓶颈，以耐高盐碱性、开放式发酵为核心优势，引领生物制造低成本、高效化发展。其核心竞争力体现在多方面：一是高效利用海水发酵，如从新疆艾丁湖分离的Halomonas campaniensis LS21和H. bluephagenesis TD，可在人工海水（27 g/L NaCl）中连续开放发酵65天，积累PHA等产物，天然节水；二是无需灭菌、能耗低，嗜盐菌在高盐高碱环境中抑制杂菌，省去灭菌步骤，同时通过合成生物学改造（如导入血红蛋白基因vgb并利用Tat途径转运至周质空间），促进低氧下氧气转运，细胞干重翻倍，结合形态学工程（如过表达minCD基因使菌丝超100μm）实现自沉降，简化下游分离；三是低成本开放式连续发酵，省去反应器清洗灭菌环节，实现培养基重复利用、产物浓度动态调控，以H. bluephagenesis为代表的菌株可在高盐碱性环境中避免杂菌污染，保障连续生产；四是易高密度培养，如H. bluephagenesis TD01衍生菌在7L小试、1-5m³中试及225m³大规模发酵中达100g/L细胞干重，P34HB含量60.4%；五是自动化生产，建立qPHA方法（PhaP1/2-GFP荧光监测PHA含量，拟合度0.99），实现产物积累实时调控；六是利用廉价碳源，除葡萄糖、淀粉外，可改造后利用厨余废料、石化副产品（甲酸、甲醇等）、农产品废料（去油米糠等）稳定生产PHA；七是产多种胞内外产品，除天然PHA（如P3HB、P34HB、PHBHHx）外，还能合成四氢嘧啶（ectABC基因调控，7L罐产量85g/L）、戊二胺（118g/L）、5-氨基戊酸（67.4g/L）等小分子，及PhaP蛋白（1.86g/L），胞内相容性溶质与PhaP分子伴侣作用保护蛋白。综上，新型生物制造较传统（CIB）具显著成本与安全优势，是未来生物制造发展方向。
表2新型生物制造(NGIB)与传统生物制造(CIB)的对比
六、未来与展望
在合成生物学、生物信息学等学科推动下，以嗜盐菌合成生物学为基础的新型生物制造快速发展，展现巨大潜力。其优势在于可利用厨余废物、纤维素水解液、糖蜜等非粮碳源，且无需灭菌即可开放连续发酵，显著提升竞争力。作为非模式微生物，嗜盐菌分子生物学工具开发起步晚，遗传背景不清、代谢流研究不足制约产量优化，未来需深化遗传与代谢研究以夯实通用底盘基础。高密度培养是提效关键，但低溶氧环境需突破低氧高活性酶开发（定向进化、分子动力学模拟理性设计），同时借助计算生物学理性设计新酶、扩展非天然产物合成。理解极端微生物抗逆性可完善开放式发酵优势，而高盐废水问题通过技术改进缓解：凌等敲除etf操纵子开发自凝絮菌株LS21，四轮发酵废水量低于常规一轮；张等用ARTP进化获低盐菌株（10g/L NaCl产75g/L P34HB），降废水处理与设备腐蚀。未来，该领域可依托远洋、海岛资源，利用海水与风电/海潮电，实现不争水争地的绿色生产，甚至发展为观光产业，传播可持续发展理念，潜力无限。
图4生物制造2.0: 基于嗜盐菌合成生物学的绿色生物制造. 生物制造2.0可以在远洋的大型船只上进行, 也可以在海岛上进行, 充分利用充裕的海水, 以及风电、 海潮发电, 实现不与人争水, 不与人争地的绿色可持续目标, 也可以发展成为观光产业, 让民众参观生物制造的同时, 感受可持续发展的概念